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| Diplomarbeiten |
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Wir haben immer wieder Diplomarbeiten zu vergeben, die im Aufbau dem unten aufgeführten Beispiel entsprechen:
„Klonierung, Produktion und Reinigung eines Cytokines in Insektenzellen (Baculovirus-Expressions) und/oder E.coli (Bakterien-Expression) sowie Vergleich der Aktivitäten im zellulären System"
Die Arbeiten umfassen die gängigen Standardmethoden der Molekularbiologie (Ligation, Transformation, Plasmidpräparation, Restriktionsanalysen, etc.), der Zellkultur (Insektenzellen, Säugerzellen, Einfrieren, Auftauen, Bioassay, etc.), der Proteinchemie (SDS-PAGE, Western Analyse, Proteinreinigung, etc) sowie die Standardmethoden zweier Expressionssysteme (Baculovirus / E.coli) und decken damit ein sehr breites Feld an Methoden ab.
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Kontakt: Dr. Bernhard Barleon |
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| DIPLOMARBEIT 2008/2009 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem LIF (Leukemina Inhibitory Factor) in E. coli. Bestimmung der biologischen Aktivität im zellulären System.
Studiengang Biotechnologie/Chemietechnik, Fachhochschule Oldenburg
Maik Lander
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| DIPLOMARBEIT 2008 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem VEGF189 in E. coli, sowie Bestimmung der Aktivität im zellulären System.
Studiengang Biotechnologie/Verfahrenstechnik, Fachhochschule Flensburg
Antje Witkopf
Zusammenfassung
Die Zielstellung der Klonierung, Produktion und Reinigung von VEGF189 sowie der Nachweis der biologischen Aktivität wurde vollständig durchgeführt. Die erhobenen Ergebnisse entsprechen den Erwartungen. Im Zuge dieser Arbeit wurden die optimalen Parameter, die Induktionstemperatur und Kultivierungszeit für die Proteinexpression ermittelt und das Reinigungsprotokoll konnte etabliert werden. Die biologische Aktivität des VEGF189 konnte durch Induktion der Proliferation sowie der Migration auf HUVEC-Zellen gezeigt werden. |
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| DIPLOMARBEIT 2007/2008 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem VE-Statin in E. coli, sowie Bestimmung der Aktivität im zellulären System.
Studiengang Biotechnologie/Verfahrenstechnik, Fachhochschule Flensburg
Helga Christina Hansen
Zusammenfassung
Das vaskuläre Endothel-Statin, auch VE-Statin oder EGFL7 genannt, wird in humanen und murinen Endothelzellen gebildet und ist erst seit einigen Jahren bekannt. Es wird vermutet, dass es ein wichtiger Faktor in der Bildung neuer Blutgefäße ist. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung rekombinanten humanen VE-Statins im E.coli - Expressionssystem. Dafür wurde die vorliegende cDNA in den pET-15b-, sowie pET-9a-Vektor geklont und im E.coli Stamm BL21 Star (DE3) produziert. Da VE-Statin äußerst schnell präzipitiert, wurden verschiedene Reinigungsprotokolle angewendet und optimiert. Da es während der Reinigung denaturiert vorliegt, ist die Renaturierung für die Wiedergewinnung der biologischen Aktivität notwendig, konnte aber im Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgreich durchgeführt werden. Weiterhin wurde bei der Expression aus dem pET-15b stets eine kleinere und scheinbar stabilere Form des VE-Statins mitproduziert. Eine Erklärung dafür wurde nicht gefunden.
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| DIPLOMARBEIT 2006/2007 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem IL-2 in E. coli sowie Bestimmung der biologischen Aktivität im zellulären System.
Studiengang Biotechnologie/Verfahrenstechnik, Fachhochschule Flensburg
Kristian Bockholt
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit konnte das humane Interleukin-2 im E.coli Expressionssystem produziert und dessen biologische Aktivität unabhängig vom verwendeten Induktionssystem nachgewiesen werden. Das Interleukin-2 wurde im E.coli Stamm BL21 Star (DE3) sowohl mithilfe der Hitze- als auch der IPTG-Induktion produziert. Ein Vergleich der Ergebnisse beider Induktionssysteme brachte eine höhere Ausbeute und auch Reinheit des IPTG-induzierten Interleukin-2 hervor. Allerdings liegt das so produzierte IL-2, unter denaturierten Bedingungen, mit zwei verschiedenen Molekulargewichten vor. Es kann im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutige Erklärung für die beim IPTG-induzierten IL-2 existierende Doppelbande gefunden werden. Die Untersuchung der Laufhöhen ergab, dass die obere, stärkere 15,5 kDa Bande im Vergleich zum hitzeinduzierten Material etwa 700 Da höher läuft. Unterschiedliche Grade an Glykosylierungen können ausgeschlossen werden und die weiteren Sequenzuntersuchungen brachten die eindeutige Identifizierung des rekombinanten IL-2 mit sich. Möglicherweise spielen die Produktionstemperatur und die Bedingungen während der Aufarbeitung der IB und bei der Renaturierung des Proteins eine große Rolle [21, 48]. Es könnte sein, dass bei der IPTG-induzierten Produktion zum Teil eine andere Akkumulation des IL-2 in E.coli erfolgt, als über Hitze-Induktion [44]. Beide IL-2 Formen sind biologisch aktiv, wobei signifikante Auswirkungen der unterschiedlichen Induktionssysteme auf die im D10.G4.1-Proliferationsassay untersuchte biologische Aktivität nicht festgestellt werden konnten. Das produzierte, rekombinante, humane Interleukin-2 benötigt kein stabilisierendes Trägerprotein während der Lyophilisierung. Die Rekonstituierung des Proteins sollte aufgrund der guten Löslichkeit in 50 mM HAc erfolgen. | |
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| DIPLOMARBEIT 2006/2007 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem IL-1ß in E. coli sowie Bestimmung der Aktivität im zellulären System.
Studiengang Biotechnologie/Chemietechnik, Abteilung Naturwissenschaftliche Technik, Fachhochschule Oldenburg/Ostfriesland/Wilhelmshaven
Christiane Pörtner
Zusammenfassung
Das Interleukin-1beta (Il-1β) ist eine Isoform des Interleukin-1 und gehört somit zu der Gruppe der Zytokine. Es wird u.a. von Makrophagen gebildet und ist ein entzündungsfördernder Signalstoff, der als Mediator zwischen Zellen wirkt und die Proliferation, Differenzierung und Funktionen der Zelle reguliert. Il-1β ist an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse im zentralen Nervensystem (ZNS) beteiligt. Außerdem trägt es zu der Immunabwehr und Entzündungsantwort durch Leberreaktionen, Herzkontraktionen und Fieberschüben bei. Im Körper wird Il-1β durch eine Immunantwort bei externem Stress (z.B. Trauma) oder internem Stress (z.B. Angstzustände, Erkrankungen) induziert. Il-1β scheint an verschiedenen neurologischen Krankheiten, wie z.B. Parkinson oder Epilepsie beteiligt zu sein, hat aber auch zellpositive Eigenschaften, da es stabilisierend auf die Homeostasis während der Unterdrückung der Immunantwort wirkt. Die Gewinnung von humanem Il-1β aus natürlichen Produzenten ist sehr ineffektiv und das Protein oft von anderen Zytokinen kontaminiert. Da jedoch das natürlich gebildete, aktive Il-1β keinen großen Unterschied zum rekombinanten Il-1β aufweist, wird in dieser Arbeit die Produktion eines aktiven, humanen, rekombinanten Il-1β beschrieben. Dazu wird die synthetisierte Il-1β cDNA in einen pET-9a Vektor kloniert und in E. coli BL21 Zellen exprimiert. Das produzierte Protein wird über mehrere Schritte, auf der Basis eines bestehenden Reinigungsprotokolls [35], aufgereinigt und dieses Protokoll optimiert, bis sich eine abschließende Reinheit von mehr als 98 % ergibt. Die Ausbeute aus einem Liter Ausgangs-E. coli-Kultur (4,63 g Zellfeuchtgewicht) beträgt 59, 21 mg. Es folgt eine Testentwicklung mit Säugerzellen, um die Aktivität von Il-1β mit Hilfe der D10.G4.1-Säugerzelllinie zu bestimmen. Somit ergibt sich, dass die Aktivität auch nach dem Lyophilisieren - mit und ohne BSA - gleich bleibt. Die maximale Stimulierung der Zellen mit Il-1β erfolgt bei einer Konzentration von 1 ng/mL. Die EC50 mit Il-1β (BL21/pET-9a) wird aus der angefertigten Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und beträgt 7,8 pg/mL. | |
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| DIPLOMARBEIT 2006 |
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Produktion und Reinigung von humanem IL-6 in E. coli (Bakterien-Expression) sowie Vergleich der Aktivitäten im zellulären System.
Hochschule Mittweida (FH), University of Applied Science; Fachbereich: Mathematik, Physik, Informatik
Carolin Rieger | |
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| PRAXISSEMESTER 2005/2006 |
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Produktion und Reinigung von Proteinen in E. coli und Insektenzellen anhand der Beispiele GM-CSF bzw. uPA.
Studiengang Biotechnologie/Chemietechnik, Fachhochschule Oldenburg
Svenja Hänel | |
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| DIPLOMARBEIT 2005/2006 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem TGF-ß1 in E. coli (Bakterien-Expression) und in Insektenzellen (Baculovirus-Expression) sowie Überprüfung im zellulären System.
Wissenschaftliche Arbeit zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplom-Biologen angefertigt an dem biotechnologischen Unternehmen RELIATech von
Marion Schmerschneider
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| DIPLOMARBEIT 2003 |
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Klonierung, Produktion und Reinigung von humanem GM-CSF in Insektenzellen (Baculovirus-Expression) und E. coli (Bakterien-Expression) sowie Vergleich der Aktivitäten im zellulären System.
Wissenschaftliche Arbeit zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplom-Industriebiologen (FH) angefertigt an dem biotechnologischen Unternehmen RELIATech von
Timo Georg Zimmermann
Zusammenfassung:
Der Granulozyten-Makrophagen Koloniestimulierende Faktor (GM-CSF) des Menschen ist ein Glykoprotein, das zur Familie der Koloniestimulierenden Faktoren (CSFs) gehört. Er spielt eine wichtige Rolle bei der Hämatopoese, der Immunantwort und der mikrobiellen Abwehr, medizinisch von Bedeutung ist er bei der Behandlung hämatopoetischer Dysfunktionen. Er wird zur Prophylaxe von Neutropenie nach myelotoxischen Therapien, nach Knochenmarkstransplantationen und zur Behandlung von Neutropenie bei AIDS Patienten eingesetzt. Weitere mögliche Anwendungsgebiete werden zur Zeit erforscht.
Die Gewinnung von GM-CSF aus seinen natürlichen Produzenten, wie beispielsweise Lymphocyten, Makrophagen und verschiedene Krebszelllinien, ist sehr uneffektiv und die Reinigung von rekombinant hergestelltem GM-CSF, die eine Kombination verschiedener Chromatographieschritte benötigt, recht aufwendig.
In dieser Arbeit wurden zwei Histidin-GM-CSF Fusionsproteine hergestellt. GM-CSF mit N-termi-nalem Histidin-tag wurde in E. coli BL21 Star (DE3) exprimiert und aus Inclusion bodies auf-gereinigt. Sekretiertes GM-CSF mit C-terminalem Histidin-tag wurde mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems in Sf 9 Zellen synthetisiert. Beide Proteine ließen sich in einem einzigen Reinigungsschritt unter nativen Bedingungen über eine Cobaltsäule in mindestens 90 %iger Reinheit gewinnen. Die Ausbeuten lagen bei 120 µg/L aus E. coli und 14 mg/L aus Sf 9 Zellen. Die biologische Aktivität der Proteine wurde an der GM-CSF-abhängigen, humanen Säugerzelllinie TF-1 ausgetestet. Beide Fusionsproteine zeigten im Vergleich zu einem rhGM-CSF ohne Histisin-tag aus E. coli die gleiche biologische Aktivität und konnten ohne Aktivitätsverlust lyophilisiert werden. Die maximale Stimulierung wurde bei beiden Proteinen mit einer Konzentration von 1 ng/mL erreicht. Die ED50 von his-GM-CSF aus E. coli lag bei 0,1 ng/mL, für his-GM-CSF aus Sf 9 lag sie bei 0,09 ng/mL. | |
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| DIPLOMARBEIT 2002 |
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Klonierung, Expression und Reinigung von EG-VEGF in Insektenzellen (Baculovirus-Expressions-System) und E.coli (Bakterien-Expression-System) sowie Überprüfung der biologischen Aktivität des Proteins mittels Bioassays in primären Säugerzellen
Wissenschaftliche Arbeit zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplom-Biotechnologen, angefertigt an dem biotechnologischen Unternehmen RELIATech von
Heiko Steffen
Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe des bakteriellen (BES) und des eukaryotischen Baculo-Virus (BVS) Expressionssystems das humane EG-VEGF erfolgreich produziert und dessen biologische zellspezifische Aktivität auf ACE-Zellen nachgewiesen werden. Das EG-VEGF wurde in den E. coli-Stämmen BL21-CodonPlusTM (DE3)-RIL und BL21 StarTM (DE3) als Fusionsprotein mit einem N-terminaler Histidin-tag und in den verwendeten Insektenzelllinien H5 und Sf9 mit einem C-terminalen Histidin-tag expremiert. Die Transkription des EG-VEGF im BES wurde durch IPTG induziert. Die Aufreinigung des ca. 9 kDa großen Proteins erfolgte nicht aus dem Cytosol sondern aus den „inclusion bodies“ des BL21 StarTM (DE3)-Stammes. Nach Renaturierung wurde das His-getaggte Protein über Affinitätschromatogeaphie mit einer Ni2+-Säule aufgereinigt.
Das in Insektenzellen produzierte EG-VEGF wurde mit einer Kombinantion aus Heparin-Sepharose- und Nickel-Säule aufgereinigt. Die Größe des EG-VEGF betrug ca. 12 und 14 kDa. Es handelt sich bei diesen zwei Molekulargewichten wahrscheinlich um unterschiedliche Glykosilierungsmodifikationen eines Monomers, welches Disulfidbrücken innerhalb desselben Polypeptides ausbildet.
Die primären HUVE- und ACE- Zellen wurden hinsichtlich ihrer Stimulierbarkeit durch humane EG-VEGF aus beiden Expressionssystemen überprüft. EG-VEGF zeigt eine konzentrationsabhängige mitogene Aktivität auf ACE-Zellen. Im Proliferationstest und DNA-Synthesetest konnte dagegen keine Stimulation der HUVE-Zellen durch EG-VEGF festgestellt werden. Dadurch konnte die gewebespezifische Aktivität des EG-VEGF bestätigt werden. | |
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| DIPLOMARBEIT 2001/2002 |
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Klonierung, Expression und Reinigung von löslichem humanem FGF Rezeptor 2 in Insektenzellen sowie Überprüfung der biologischen Aktivität in humanen primären Zellen
Wissenschaftliche Arbeit zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplom-Biologen, angefertigt an dem biotechnologischen Unternehmen RELIATech von
Tanja Hundermark
Zusammenfassung:
1. In der vorliegenden Arbeit wurde der hsFGFR2-hFc in Sf9-Insektenzellen durch das Baculovirus-Expressionssystem (BEVS) hergestellt und aufgereinigt.
2. Die biologische Aktivität des hsFGFR2-hFc wurde an verschiedenen primären Zellen sowie NIH 3T3-Zellen überprüft. Der lösliche Rezeptor konnte die mitogene Wirkung von bFGF durch Bindung des Liganden inhibieren.
3. Ein auf dem hsFGFR2-hFc basierender RELIDA zur Detektion biologisch aktiven bFGFs wurde entwickelt. Allerdings sthet die Entwicklung des RELIDAs noch am Anfang. | |
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